تفاوت بین PCR، RT-PCR، qPCR، و RT-qPCR چیست؟

ُ

تفاوت بین PCR، RT-PCR، qPCR، و RT-qPCR چیست؟

ُ
RT-PCR، qPCR یکی دیگر از دستگاههای آزمایشگاهی است که نیاز به کاور محافظ گرد و غبار دارد.کاور تجهیزات بهفر طی سالهای احیر بالغ بر هزاران سفارش جهت تولید کاور دستگاههای ترموسایکلر یا پی سی آر داشته است.این تجهیزات به دلیل حساسیت بالا نیاز مبرمی به کاور محافظ دارد.یک تماس با ما کافیست تا بهترین و شیک ترین کاورهای موجود در ایران را برای دستگاه پس سی آر خود تهیه کنید.

ُ

تفاوت بین PCR، RT-PCR، qPCR، و RT-qPCR چیست؟

تفاوت بین PCR، RT-PCR، qPCR، و RT-qPCR چیست؟

ُ

این مطلب ترجمه ایست از این مقاله

ُ
PCR روشی است که برای تکثیر DNA از مقدار کمی الگوی DNA استفاده می شود. RT-PCR از رونویسی معکوس برای تولید یک الگوی DNA از منبع RNA استفاده می کند که می تواند سپس تقویت شود.
PCR و RT-PCR معمولاً واکنش‌های نقطه پایانی هستند، در حالی که qPCR و RT-qPCR از سینتیک سرعت سنتز محصول در طول واکنش PCR برای کمی کردن مقدار الگوی موجود استفاده می‌کنند.
روش های جدیدتر، مانند PCR دیجیتال، کمیت مطلق الگوی DNA اولیه را ارائه می دهند، در حالی که روش هایی مانند PCR همدما نیاز به تجهیزات گران قیمت را برای ارائه نتایج قابل اعتماد کاهش می دهند.

ُ

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک بیولوژی مولکولی نسبتاً ساده و پرکاربرد برای تقویت و شناسایی توالی‌های DNA و RNA است. در مقایسه با روش‌های سنتی شبیه‌سازی و تکثیر DNA، که اغلب ممکن است روزها طول بکشد، PCR تنها به چند ساعت نیاز دارد. PCR بسیار حساس است و برای تشخیص و تقویت توالی های خاص به حداقل قالب نیاز دارد. روش های اساسی PCR از تشخیص ساده DNA و RNA بیشتر پیشرفت کرده اند. در زیر، ما یک نمای کلی از روش‌های مختلف PCR و معرف‌هایی که در Enzo Life Sciences برای نیازهای تحقیقاتی شما ارائه می‌کنیم، ارائه کرده‌ایم. هدف ما کمک به دانشمندان برای دسترسی سریع به معرف های PCR برای استفاده در پروژه تحقیقاتی بعدی خود است!

ُ

 یا ترموسایکلر PCR

ُ
برای PCR استاندارد، تنها چیزی که نیاز دارید یک DNA پلیمراز، منیزیم، نوکلئوتیدها، پرایمرها، الگوی DNA برای تقویت و یک ترموسایکلر است. مکانیسم PCR به اندازه هدف آن ساده است: ۱) DNA دو رشته ای (dsDNA) گرما دناتوره می شود، ۲) پرایمرها با رشته های DNA منفرد همراستا می شوند و ۳) پرایمرها توسط DNA پلیمراز گسترش می یابند که منجر به دو نسخه از DNA می شود. رشته DNA اصلی فرآیند دناتوره شدن، بازپخت و طویل شدن طی یک سری دما و زمان به عنوان یک چرخه تقویت شناخته می شود (شکل ۱).
هر مرحله از چرخه باید برای قالب و مجموعه پرایمر استفاده شده بهینه شود. این چرخه تقریباً ۲۰ تا ۴۰ بار تکرار می شود و محصول تقویت شده را می توان به طور معمول توسط ژل آگارز تجزیه و تحلیل کرد (شکل ۲).
از آنجایی که PCR یک روش بسیار حساس است و حجم بسیار کمی برای واکنش های منفرد مورد نیاز است، تهیه یک مخلوط اصلی برای چندین واکنش توصیه می شود. مخلوط اصلی باید به خوبی مخلوط شود و سپس بر اساس تعداد واکنش ها تقسیم شود، تا اطمینان حاصل شود که هر واکنش حاوی همان مقدار آنزیم، dNTPs و آغازگرها خواهد بود. بسیاری از تامین کنندگان، مانند Enzo Life Sciences، مخلوط های PCR را نیز ارائه می دهند که از قبل حاوی همه چیز به جز پرایمرها و الگوی DNA هستند.
نواحی غنی از گوانین/سیتوزین (غنی از GC) یک چالش در تکنیک های استاندارد PCR است. توالی های غنی از GC پایدارتر از توالی هایی با محتوای GC کمتر هستند. علاوه بر این، توالی های غنی از GC تمایل به تشکیل ساختارهای ثانویه، مانند حلقه های سنجاق سر دارند. در نتیجه جدا شدن کامل رشته های دوگانه غنی از GC در مرحله دناتوراسیون دشوار است. در نتیجه، DNA پلیمراز نمی تواند رشته جدید را بدون مانع سنتز کند. دمای دناتوراسیون بالاتر می تواند این را بهبود بخشد، و تنظیمات به سمت دمای بازپخت بالاتر و زمان بازپخت کوتاه تر می تواند از اتصال غیر اختصاصی پرایمرهای غنی از GC جلوگیری کند. معرف های اضافی می توانند تقویت توالی های غنی از GC را افزایش دهند. DMSO، گلیسرول و بتائین به برهم زدن ساختارهای ثانویه ناشی از فعل و انفعالات GC کمک می کنند و در نتیجه جداسازی رشته های دوتایی را تسهیل می کنند.

ُ

ُ

Hot Start PCR

ُ
تقویت نامشخص مشکلی است که می تواند در حین PCR رخ دهد. اکثر DNA پلیمرازهایی که برای PCR استفاده می شوند در دمای حدود ۶۸ تا ۷۲ درجه سانتی گراد بهترین عملکرد را دارند. با این حال، آنزیم می تواند در دماهای پایین تر نیز فعال باشد، هرچند در درجه پایین تر. در دماهای بسیار کمتر از دمای بازپخت، پرایمرها می توانند به طور غیر اختصاصی متصل شوند و منجر به تقویت غیر اختصاصی شوند، حتی اگر واکنش روی یخ تنظیم شود. می توان با استفاده از مهارکننده های پلیمراز که تنها پس از رسیدن به دمای معین از DNA پلیمراز جدا می شوند، از این امر جلوگیری کرد، از این رو اصطلاح PCR شروع گرم می باشد. بازدارنده می تواند آنتی بادی باشد که به پلیمراز متصل می شود و در دمای دناتوراسیون اولیه (معمولاً ۹۵ درجه سانتیگراد) دناتوره می شود.

پلیمراز با کیفیت بالا

ُ
در حالی که DNA پلیمرازها با دقت نسبتاً زیادی به دنباله الگوی اصلی تقویت می شوند، ممکن است اشتباهاتی در تطابق نوکلئوتیدی رخ دهد. عدم تطابق در برنامه‌هایی مانند شبیه‌سازی می‌تواند منجر به رونوشت‌های کوتاه‌شده، و ترجمه اشتباه یا پروتئین‌های غیرفعال در پایین دست شود. برای جلوگیری از این عدم تطابق، پلیمرازهایی با فعالیت “تصحیح” شناسایی و در جریان کار گنجانده شده اند. اولین پلیمراز تصحیح کننده، Pfu، در سال ۱۹۹۱ در Pyrococcus furiosus شناسایی شد. این آنزیم Pfu دارای فعالیت اگزونوکلئاز ۳ تا ۵ است. همانطور که DNA تکثیر می شود، اگزونوکلئاز نوکلئوتیدهای ناهماهنگ را در انتهای ۳ رشته حذف می کند. سپس نوکلئوتید صحیح جایگزین می شود و سنتز DNA ادامه می یابد. شناسایی توالی های نوکلئوتیدی نادرست بر اساس میل اتصال به تری فسفات نوکلئوزیدی صحیح با آنزیم است، جایی که اتصال ناکارآمد سنتز را کند می کند و امکان جایگزینی صحیح را فراهم می کند. فعالیت تصحیح پلیمراز Pfu منجر به خطاهای کمتری در توالی نهایی در مقایسه با Taq DNA پلیمراز می شود. در سال‌های اخیر، آنزیم‌های تصحیح‌کننده دیگری شناسایی شده‌اند و تغییراتی در آنزیم اصلی Pfu برای کاهش بیشتر میزان خطا در طی تکثیر DNA انجام شده است.

ُ

ُ

RT-PCR

ُ
PCR رونویسی معکوس یا RT-PCR، امکان استفاده از RNA را به عنوان الگو فراهم می کند. یک مرحله اضافی امکان تشخیص و تقویت RNA را فراهم می کند. RNA با استفاده از ترانس کریپتاز معکوس به DNA مکمل (cDNA) رونویسی معکوس می شود. کیفیت و خلوص الگوی RNA برای موفقیت RT-PCR ضروری است. اولین مرحله RT-PCR، سنتز هیبرید DNA/RNA است. ترانس کریپتاز معکوس همچنین دارای یک تابع RNase H است که بخش RNA هیبرید را تخریب می کند. سپس مولکول DNA تک رشته ای با فعالیت DNA پلیمراز وابسته به DNA از رونوشت معکوس به cDNA تکمیل می شود. راندمان واکنش رشته اول می تواند بر روند تقویت تأثیر بگذارد. از اینجا به بعد، روش استاندارد PCR برای تقویت cDNA استفاده می شود. امکان برگرداندن RNA به cDNA توسط RT-PCR دارای مزایای زیادی است و در درجه اول برای تجزیه و تحلیل بیان ژن استفاده می شود. RNA تک رشته ای و بسیار ناپایدار است که کار با آن را چالش برانگیز می کند. معمولاً به عنوان اولین مرحله در qPCR عمل می کند، که رونوشت های RNA را در یک نمونه بیولوژیکی کمی می کند.

ُ

ُ

qPCR

 RT-qPCR
PCR کمی (qPCR) برای شناسایی، تعیین و تعیین کمیت اسیدهای نوکلئیک برای کاربردهای متعدد استفاده می شود. در RT-qPCR، رونوشت‌های RNA اغلب با رونویسی معکوس آنها در cDNA، همانطور که در بالا توضیح داده شد، اندازه‌گیری می‌شوند و سپس qPCR متعاقبا انجام می‌شود. همانند PCR استاندارد، DNA با سه مرحله تکراری تقویت می شود: دناتوراسیون، بازپخت و ازدیاد طول. با این حال، در qPCR، برچسب زدن فلورسنت جمع آوری داده ها را با پیشرفت PCR امکان پذیر می کند. این تکنیک به دلیل طیف وسیعی از روش ها و شیمی های موجود، مزایای زیادی دارد.

ُ

در qPCR مبتنی بر رنگ (معمولا سبز)، برچسب زدن فلورسنت امکان تعیین کمی مولکول های DNA تقویت شده را با استفاده از رنگ اتصال dsDNA فراهم می کند. در طول هر چرخه، فلورسانس اندازه گیری می شود. سیگنال فلورسانس متناسب با مقدار DNA تکثیر شده افزایش می یابد. از این رو، DNA در “زمان واقعی” کمیت می شود (شکل ۳). معایب qPCR مبتنی بر رنگ این است که تنها یک هدف را می توان در یک زمان مورد بررسی قرار داد و اینکه رنگ به هر ds-DNA موجود در نمونه متصل می شود.
در qPCR مبتنی بر پروب، بسیاری از اهداف را می توان به طور همزمان در هر نمونه شناسایی کرد، اما این امر مستلزم بهینه سازی و طراحی یک پروب(های) خاص هدف است که علاوه بر پرایمرها استفاده می شود. انواع مختلفی از طرح های کاوشگر موجود است، اما رایج ترین نوع، پروب هیدرولیز است که دارای فلوروفور و خاموش کننده است. انتقال انرژی تشدید فلورسانس (FRET) از انتشار فلوروفور از طریق کوئنچر در حالی که پروب دست نخورده است جلوگیری می کند. با این حال، در طی واکنش PCR، پروب در طول گسترش پرایمر و تقویت توالی خاصی که به آن متصل است، هیدرولیز می شود. برش پروب فلوروفور را از خاموش کننده جدا می کند و منجر به افزایش وابسته به تقویت در فلورسانس می شود (شکل ۴). بنابراین، سیگنال فلورسانس از یک واکنش qPCR مبتنی بر پروب متناسب با مقدار توالی هدف پروب موجود در نمونه است. از آنجایی که qPCR مبتنی بر پروب خاص‌تر از qPCR مبتنی بر رنگ است، این فناوری اغلب در سنجش‌های تشخیصی مبتنی بر qPCR استفاده می‌شود.

ُ

ُ
تقویت همدما

ُ
تکنیک‌های PCR که در بالا ذکر شد به تجهیزات گران‌قیمت ترموسایکلینگ نیاز دارد تا دمای محفظه را با دقت بالا و پایین برای مراحل دناتوره‌سازی، بازپخت کردن و گسترش افزایش دهد. تعدادی از تکنیک ها توسعه یافته اند که نیازی به چنین دستگاه های دقیقی ندارند و می توانند در یک حمام آب ساده یا حتی در سلول های مورد نظر انجام شوند. این تکنیک ها در مجموع تقویت همدما نامیده می شوند و بر اساس تقویت نمایی، خطی یا آبشاری کار می کنند.
شناخته شده ترین نوع تقویت همدما، تقویت همدما با واسطه حلقه یا LAMP است. LAMP از تقویت نمایی در دمای ۶۵⁰C برای تقویت DNA یا RNA الگو استفاده می کند. هنگام اجرای LAMP، چهار تا شش آغازگر مکمل نواحی DNA هدف با یک DNA پلیمراز برای سنتز DNA جدید استفاده می شود. دو تا از این آغازگرها دارای توالی‌های تکمیلی هستند که توالی‌ها را در پرایمرهای دیگر تشخیص می‌دهند و آن‌ها را متصل می‌کنند، که اجازه می‌دهد یک ساختار “حلقه” در DNA تازه سنتز شده تشکیل شود که سپس به بازپخت پرایمر در دورهای بعدی تقویت کمک می‌کند. LAMP را می توان با روش های متعددی از جمله فلورسانس، الکتروفورز ژل آگارز یا رنگ سنجی مشاهده کرد. سهولت تجسم و تشخیص وجود یا عدم وجود محصول توسط رنگ سنجی و نبود تجهیزات گران قیمت مورد نیاز، LAMP را به گزینه ای مناسب برای آزمایش SARS-CoV-2 در مناطقی که آزمایش آزمایشگاهی بالینی به راحتی در دسترس نبود، یا نگهداری و حمل و نقل نمونه ها تبدیل کرده است. امکان پذیر نبود یا در آزمایشگاه هایی که قبلاً تجهیزات ترموسایکلینگ PCR نداشتند.

ُ

ُ

دیجیتال PCR چیست؟

ُ
در حالی که qPCR و RT-qPCR کمی در نظر گرفته می شوند، آنها فقط کمیت نسبی را ارائه می دهند زیرا نتایج با توجه به بیان یک ژن کنترل یا “خانه دار” یا یک منحنی استاندارد تولید شده از طریق رقت های سریالی گزارش می شود. برای ارائه یک کمیت مطلق، PCR دیجیتال توسعه داده شد. با PCR دیجیتال، به جای محاسبه بر اساس مقدار محصول PCR، می توان تعداد کل اهداف DNA اولیه را کمیت کرد. این کمی سازی اهداف اولیه DNA توسط سایکس و همکاران توسعه داده شد. ۱ با استفاده از رقت نمونه و آمار پواسون. در آمار پواسون، احتمال وقوع چیزی (یا در مورد PCR دیجیتال، بیان ژن هدف مورد نظر) بر اساس وقوع در یک مجموعه شناخته شده از رویدادها محاسبه می شود (شکل ۵A). مجموعه شناخته شده رویدادها با رقت محدود نمونه اولیه تعیین شد. در سال ۱۹۹۹، Vogelstein و Kinzler2 با رقیق کردن نمونه‌ها به اندازه‌ای که مقدار الگو در هر یک از آنها می‌توان بدون رقابت با سایر اهداف توسط PCR تقویت شد، این کار را یک قدم فراتر بردند و حساسیت PCR دیجیتال را افزایش دادند. DNA توسط یک کاوشگر فلورسنت خاص برای هدف شناسایی می شود. این نمونه‌های اولیه اکنون دیگر به سادگی رقیق نمی‌شوند، بلکه با چندین روش مختلف تکنولوژیکی به بخش‌هایی تقسیم می‌شوند. برخی از روش ها نمونه را تکه تکه می کنند تا روی یک تراشه ریزآرایه با هزاران پروب اعمال شود که سپس می توان آنها را با PCR تقویت کرد. برخی دیگر از میکروسیال ها برای تشریح نمونه استفاده می کنند که در آن تقویت می تواند رخ دهد.
یکی از روش‌های تجاری استاندارد، پراکنده کردن DNA الگو به هزاران قطره مایع است که هر قطره حاوی کمترین مولکول الگو باشد (شکل ۱B). وجود یا عدم وجود DNA هدف در هر قطره یکی از “رویدادهایی” است که توسط آمار پواسون استفاده می شود. هر قطره منفرد DNA درون خود را تقویت می کند و تعداد قطراتی که هدف DNA مورد نظر را دارند تعیین می شود. محاسبات بر اساس تعداد کل قطرات حاوی DNA هدف انجام می شود. بنابراین این فرآیند به عنوان PCR دیجیتال مبتنی بر قطره یا ddPCR شناخته می شود. از آنجایی که کمیت بر اساس وجود یا عدم وجود هدف تعیین می‌شود، تنوع کمتری از متغیرهای بازده PCR وجود دارد که می‌تواند آستانه چرخه (Ct) و بنابراین، تغییرات کمتری در محاسبه را تحت تأثیر قرار دهد.
مزایای PCR دیجیتال باعث شده است که استفاده از آن در چندین برنامه کاربردی گنجانده شود. مقادیر کم RNA موجود در نمونه‌های بیوپسی مایع، PCR دیجیتال را برای این نوع تشخیص‌ها، آنالیز نمونه‌های تک سلولی و شناسایی مقادیر کم پاتوژن‌ها در طول عفونت اولیه ایده‌آل می‌کند. PCR دیجیتال همچنین امکان تشخیص توالی‌های نادر و تغییرات تعداد کپی را فراهم می‌کند، زیرا DNA پس‌زمینه کمتری در هر پارتیشن برای پوشاندن تقویت خاص وجود دارد.

ُ

ُ

ُ

مطالب مرتبط:
کاور کواگلومتر-معرفی و بهترین برند ها
کاور تست کشش یونیورسال
داستان اختراع تست پی سی آرPCR
کاور پرینتر سه بعدی

دیدگاهتان را بنویسید